Javascript är för närvarande inaktiverat i din webbläsare.När javascript är inaktiverat kommer vissa funktioner på denna webbplats inte att fungera.
Javier Fidalgo, * Pierre-Antoine Deglesne, * Rodrigo Arroyo, * Lilian Sepúlveda, * Evgeniya Ranneva, Philippe Deprez Institutionen för vetenskap, Skin Tech Pharma Group, Castello D'Empúries, Katalonien, Spanien * Dessa författare har några insikter i detta verk Equal bidragsbakgrund: Hyaluronsyra (HA) är en naturligt förekommande polysackarid som används vid framställning av hudfyllmedel för estetiska ändamål.Eftersom det har en halveringstid på flera dagar i mänsklig vävnad, modifieras HA-baserade hudfyllmedel kemiskt för att förlänga deras livslängd i kroppen.Den vanligaste modifieringen i kommersiella HA-baserade fyllmedel är användningen av 1,4-butandioldiglycidyleter (BDDE) som ett tvärbindningsmedel för att tvärbinda HA-kedjorna.Återstående eller oreagerad BDDE anses vara ogiftig vid <2 delar per miljon (ppm);därför måste resterande BDDE i det slutliga hudfyllmedlet kvantifieras för att säkerställa patientsäkerheten.Material och metoder: Denna studie beskriver detektion och karakterisering av en biprodukt av tvärbindningsreaktionen mellan BDDE och HA under alkaliska förhållanden genom att kombinera vätskekromatografi och masspektrometri (LC-MS).Resultat: Efter olika analyser fann man att de alkaliska förhållandena och den höga temperaturen som användes för att desinficera HA-BDDE-hydrogelen främjade bildningen av denna nya biprodukt, den "propylenglykolliknande" föreningen.LC-MS-analys bekräftade att biprodukten har samma monoisotopiska massa som BDDE, en annan retentionstid (tR) och ett annat UV-absorbansläge (λ=200 nm).Till skillnad från BDDE observerades det i LC-MS-analys att under samma mätförhållanden har denna biprodukt en högre detektionshastighet vid 200 nm.Slutsats: Dessa resultat indikerar att det inte finns någon epoxid i strukturen av denna nya förening.Diskussionen är öppen för att bedöma risken för denna nya biprodukt som finns vid produktionen av HA-BDDE hydrogel (HA dermalt fyllmedel) för kommersiella ändamål.Nyckelord: hyaluronsyra, HA dermal filler, tvärbunden hyaluronsyra, BDDE, LC-MS analys, BDDE biprodukt.
Fyllmedel baserade på hyaluronsyra (HA) är de vanligaste och populäraste hudfyllmedlen som används för kosmetiska ändamål.1 Detta hudfyllmedel är en hydrogel, vanligtvis sammansatt av >95% vatten och 0,5-3% HA, vilket ger dem en gelliknande struktur.2 HA är en polysackarid och huvudkomponenten i den extracellulära matrisen hos ryggradsdjur.En av ingredienserna.Den består av (1,4)-glukuronsyra-β (1,3)-N-acetylglukosamin (GlcNAc) repeterande disackaridenheter förbundna med glykosidbindningar.Detta disackaridmönster är detsamma i alla organismer.Jämfört med vissa proteinbaserade fyllmedel (som kollagen) gör denna egenskap HA till en mycket biokompatibel molekyl.Dessa fyllmedel kan uppvisa aminosyrasekvensspecificitet som kan kännas igen av patientens immunsystem.
När det används som ett hudfyllmedel, är den huvudsakliga begränsningen för HA dess snabba omsättning i vävnaderna på grund av närvaron av en specifik familj av enzymer som kallas hyaluronidaser.Hittills har flera kemiska modifieringar i HA-strukturen beskrivits för att öka halveringstiden för HA i vävnader.3 De flesta av dessa modifieringar försöker minska tillgången av hyaluronidas till polysackaridpolymerer genom att tvärbinda HA-kedjor.På grund av bildandet av broar och de intermolekylära kovalenta bindningarna mellan HA-strukturen och tvärbindningsmedlet, producerar därför den tvärbundna HA-hydrogelen mer anti-enzymnedbrytningsprodukter än den naturliga HA.4-6
Hittills inkluderar de kemiska tvärbindningsmedel som används för att producera tvärbunden HA metakrylamid, 7 hydrazid, 8 karbodiimid, 9 divinylsulfon, 1,4-butandioldiglycidyleter (BDDE) och poly(etylenglykol)diglycidyleter.10,11 BDDE är för närvarande det mest använda tvärbindningsmedlet.Även om dessa typer av hydrogeler har visat sig vara säkra i årtionden, är de tvärbindande medlen som används reaktiva reagens som kan vara cytotoxiska och i vissa fall mutagena.12 Därför måste deras resthalt i den slutliga hydrogelen vara hög.BDDE anses säkert när restkoncentrationen är mindre än 2 miljondelar (ppm).4
Det finns flera metoder för att detektera lågrester av BDDE-koncentration, tvärbindningsgrad och substitutionsposition i HA-hydrogeler, såsom gaskromatografi, storleksexklusionskromatografi kopplad med masspektrometri (MS), kärnmagnetisk resonans (NMR) fluorescensmätningsmetoder, och Diodarray-kopplad högpresterande vätskekromatografi (HPLC).13-17 Denna studie beskriver detektion och karakterisering av en biprodukt i den slutliga tvärbundna HA-hydrogelen som produceras genom reaktion mellan BDDE och HA under alkaliska förhållanden.HPLC och vätskekromatografi-masspektrometri (LC-MS analys).Eftersom toxiciteten hos denna biprodukt av BDDE är okänd rekommenderar vi att kvantifieringen av dess resthalter bestäms på ett liknande sätt som den metod som vanligtvis utförs på BDDE i slutprodukten.
Det erhållna natriumsaltet av HA (Shiseido Co., Ltd., Tokyo, Japan) har en molekylvikt på ~1 368 000 Da (Laurent-metoden) 18 och en gränsviskositet på 2,20 m3/kg.För tvärbindningsreaktionen köptes BDDE (≥95%) från Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA).Fosfatbuffrad saltlösning med pH 7,4 köptes från Sigma-Aldrich Company.Alla lösningsmedel, acetonitril och vatten som användes i LC-MS-analysen köptes från HPLC-kvalitet.Myrsyra (98%) köps som reagenskvalitet.
Alla experiment utfördes på ett UPLC Acquity-system (Waters, Milford, MA, USA) och anslutna till en API 3000 trippelkvadrupolmasspektrometer utrustad med en elektrosprayjoniseringskälla (AB SCIEX, Framingham, MA, USA).
Syntesen av tvärbundna HA-hydrogeler påbörjades genom att tillsätta 198 mg BDDE till en 10 % (vikt/vikt) lösning av natriumhyaluronat (NaHA) i närvaro av 1 % alkali (natriumhydroxid, NaOH).Den slutliga BDDE-koncentrationen i reaktionsblandningen var 9,9 mg/ml (0,049 mM).Därefter blandades reaktionsblandningen noggrant och homogeniserades och fick fortgå vid 45°C under 4 timmar.19 Reaktionens pH hålls vid ~12.
Därefter tvättades reaktionsblandningen med vatten och den slutliga HA-BDDE-hydrogelen filtrerades och späddes med PBS-buffert för att uppnå en HA-koncentration av 10 till 25 mg/ml och ett slutligt pH på 7,4.För att sterilisera de producerade tvärbundna HA-hydrogelerna autoklaveras alla dessa hydrogeler (120°C under 20 minuter).Den renade BDDE-HA-hydrogelen förvaras vid 4°C fram till analys.
För att analysera BDDE som finns i den tvärbundna HA-produkten vägdes ett 240 mg prov och infördes i mitthålet (Microcon®; Merck Millipore, Billerica, MA, USA; volym 0,5 ml) och centrifugerades vid 10 000 rpm vid rumstemperatur 10 minuter.Totalt 20 µL neddragningsvätska uppsamlades och analyserades.
För att analysera BDDE-standarden (Sigma-Aldrich Co) under alkaliska förhållanden (1 %, 0,1 % och 0,01 % NaOH), om följande villkor är uppfyllda, är vätskeprovet 1:10, 1:100 eller upp till 1:1 000 000 Använd vid behov MilliQ avjoniserat vatten för analys.
För utgångsmaterialen som användes i tvärbindningsreaktionen (HA 2%, H2O, 1% NaOH och 0,049 mM BDDE), analyserades 1 ml av varje prov framställt från dessa material med användning av samma analysbetingelser.
För att bestämma specificiteten för topparna som uppträder i jonkartan sattes 10 µL 100 ppb BDDE-standardlösning (Sigma-Aldrich Co) till 20 µL provet.I detta fall är den slutliga koncentrationen av standarden i varje prov 37 ppb.
Förbered först en BDDE-stamlösning med en koncentration av 11 000 mg/L (11 000 ppm) genom att späda 10 μL standard-BDDE (Sigma-Aldrich Co) med 990 μL MilliQ-vatten (densitet 1,1 g/ml).Använd denna lösning för att bereda en 110 µg/L (110 ppb) BDDE-lösning som en mellanliggande standardutspädning.Använd sedan det mellanliggande BDDE-standardspädningsmedlet (110 ppb) för att förbereda standardkurvan genom att späda mellanspädningsmedlet flera gånger för att uppnå önskad koncentration på 75, 50, 25, 10 och 1 ppb.Som visas i figur 1 har det visat sig att BDDE-standardkurvan från 1,1 till 110 ppb har god linjäritet (R2>0,99).Standardkurvan upprepades i fyra oberoende experiment.
Figur 1 BDDE-standardkalibreringskurva erhållen genom LC-MS-analys, där en god korrelation observeras (R2>0,99).
Förkortningar: BDDE, 1,4-butandioldiglycidyleter;LC-MS, vätskekromatografi och masspektrometri.
För att identifiera och kvantifiera BDDE-standarderna som finns i den tvärbundna HA- och BDDE-standarderna i baslösningen användes LC-MS-analys.
Den kromatografiska separationen uppnåddes på en LUNA 2,5 µm C18(2)-HST-kolonn (50×2,0 mm2; Phenomenex, Torrance, CA, USA) och hölls vid rumstemperatur (25°C) under analysen.Den mobila fasen består av acetonitril (lösningsmedel A) och vatten (lösningsmedel B) innehållande 0,1 % myrsyra.Den mobila fasen elueras genom gradienteluering.Gradienten är som följer: 0 minuter, 2% A;1 minut, 2% A;6 minuter, 98% A;7 minuter, 98% A;7,1 minuter, 2% A;10 minuter, 2 % A. Drifttiden är 10 minuter och injektionsvolymen är 20 µL.Retentionstiden för BDDE är cirka 3,48 minuter (från 3,43 till 4,14 minuter baserat på experiment).Den mobila fasen pumpades med en flödeshastighet av 0,25 ml/min för LC-MS-analys.
För BDDE-analys och kvantifiering av MS kombineras UPLC-systemet (Waters) med en API 3000 trippelkvadrupolmasspektrometer (AB SCIEX) utrustad med en elektrosprayjoniseringskälla, och analysen utförs i positivt jonläge (ESI+).
Enligt jonfragmentanalysen utförd på BDDE, bestämdes fragmentet med den högsta intensiteten vara det fragment som motsvarar 129,1 Da (Figur 6).Därför, i multijonövervakningsläget (MIM) för kvantifiering, är massomvandlingen (massa-till-laddningsförhållandet [m/z]) för BDDE 203,3/129,1 Da.Den använder också fullskanningsläge (FS) och produktjonskanningsläge (PIS) för LC-MS-analys.
För att verifiera metodens specificitet analyserades ett blankprov (initial mobil fas).Ingen signal detekterades i blankprovet med en massomvandling av 203,3/129,1 Da.Beträffande experimentets repeterbarhet analyserades 10 standardinjektioner på 55 ppb (i mitten av kalibreringskurvan), vilket resulterade i en återstående standardavvikelse (RSD) <5 % (data visas ej).
Det kvarvarande BDDE-innehållet kvantifierades i åtta olika autoklaverade BDDE-tvärbundna HA-hydrogeler, motsvarande fyra oberoende experiment.Som beskrivs i avsnittet "Material och metoder" utvärderas kvantifieringen av medelvärdet för regressionskurvan för BDDE-standardutspädningen, vilket motsvarar den unika topp som detekteras vid BDDE-massövergången på 203,3/129,1 Da, med en retention tid på 3,43 till 4,14 minuter Väntar inte.Figur 2 visar ett exempel på ett kromatogram av 10 ppb BDDE-referensstandarden.Tabell 1 sammanfattar det kvarvarande BDDE-innehållet i åtta olika hydrogeler.Värdeintervallet är 1 till 2,46 ppb.Därför är den kvarvarande BDDE-koncentrationen i provet acceptabel för mänsklig användning (<2 ppm).
Figur 2 Jonkromatogram av 10 ppb BDDE-referensstandard (Sigma-Aldrich Co), MS (m/z)-övergång erhållen genom LC-MS-analys av 203.30/129.10 Da (i positivt MRM-läge).
Förkortningar: BDDE, 1,4-butandioldiglycidyleter;LC-MS, vätskekromatografi och masspektrometri;MRM, multipel reaktionsövervakning;MS, massa;m/z, förhållande mellan massa och laddning.
Obs: Prov 1-8 är autoklaverade BDDE-tvärbundna HA-hydrogeler.Den kvarvarande mängden BDDE i hydrogelen och toppen av BDDE-retentionstiden rapporteras också.Slutligen redovisas också förekomsten av nya toppar med olika retentionstider.
Förkortningar: BDDE, 1,4-butandioldiglycidyleter;HA, hyaluronsyra;MRM, multipel reaktionsövervakning;tR, retentionstid;LC-MS, vätskekromatografi och masspektrometri;RRT, relativ retentionstid.
Överraskande nog visade analysen av LC-MS-jonkromatogrammet att baserat på alla analyserade autoklaverade tvärbundna HA-hydrogelprover, fanns det en extra topp vid den kortare retentionstiden på 2,73 till 3,29 minuter.Till exempel visar figur 3 jonkromatogrammet för ett tvärbundet HA-prov, där en ytterligare topp uppträder vid en annan retentionstid på cirka 2,71 minuter.Den observerade relativa retentionstiden (RRT) mellan den nyligen observerade toppen och toppen från BDDE visade sig vara 0,79 (tabell 1).Eftersom vi vet att den nyligen observerade toppen hålls mindre kvar i C18-kolonnen som används i LC-MS-analysen, kan den nya toppen motsvara en mer polär förening än BDDE.
Figur 3 Jonkromatogram av tvärbundet HA-hydrogelprov erhållet med LC-MS (MRM-massomvandling 203,3/129,0 Da).
Förkortningar: HA, hyaluronsyra;LC-MS, vätskekromatografi och masspektrometri;MRM, multipel reaktionsövervakning;RRT, relativ retentionstid;tR, retentionstid.
För att utesluta möjligheten att de nya topparna som observerats kan vara föroreningar som ursprungligen fanns i de använda råvarorna, analyserades även dessa råvaror med samma LC-MS-analysmetod.De analyserade utgångsmaterialen inkluderar vatten, 2% NaHA i vatten, 1% NaOH i vatten och BDDE i samma koncentration som användes i tvärbindningsreaktionen.Jonkromatogrammet för det använda utgångsmaterialet visade ingen förening eller topp, och dess retentionstid motsvarar den nya topp som observerats.Detta faktum förkastar tanken att inte bara utgångsmaterialet kan innehålla några föreningar eller ämnen som kan störa analysproceduren, utan det finns inga tecken på möjlig korskontaminering med andra laboratorieprodukter.Koncentrationsvärdena som erhålls efter LC-MS-analys av BDDE och nya toppar visas i tabell 2 (prov 1-4) och jonkromatogrammet i figur 4.
Obs: Prov 1-4 motsvarar de råvaror som används för att producera autoklaverade BDDE-tvärbundna HA-hydrogeler.Dessa prover autoklaverades inte.
Förkortningar: BDDE, 1,4-butandioldiglycidyleter;HA, hyaluronsyra;LC-MS, vätskekromatografi och masspektrometri;MRM, multipel reaktionsövervakning.
Figur 4 motsvarar LC-MS-kromatogrammet för ett prov av råmaterialet som används i tvärbindningsreaktionen av HA och BDDE.
Notera: Alla dessa mäts vid samma koncentration och förhållande som används för att utföra tvärbindningsreaktionen.Siffrorna för de råvaror som analyserats med kromatogrammet motsvarar: (1) vatten, (2) 2% HA vattenlösning, (3) 1% NaOH vattenlösning.LC-MS-analys utförs för massomvandling av 203.30/129.10 Da (i positivt MRM-läge).
Förkortningar: BDDE, 1,4-butandioldiglycidyleter;HA, hyaluronsyra;LC-MS, vätskekromatografi och masspektrometri;MRM, multipel reaktionsövervakning.
Förhållandena som ledde till bildandet av nya toppar studerades.För att studera hur reaktionsförhållandena som används för att producera den tvärbundna HA-hydrogelen påverkar reaktiviteten hos BDDE-tvärbindningsmedlet, vilket leder till bildandet av nya toppar (möjliga biprodukter), utfördes olika mätningar.I dessa bestämningar studerade och analyserade vi den slutliga BDDE-tvärbindaren, som behandlades med olika koncentrationer av NaOH (0%, 1%, 0,1% och 0,01%) i ett vattenhaltigt medium, följt av eller utan autoklavering.Bakterieproceduren för att simulera samma förhållanden är densamma som metoden som används för att producera den tvärbundna HA-hydrogelen.Som beskrivs i avsnittet "Material och metoder" analyserades massövergången av provet av LC-MS till 203.30/129.10 Da.BDDE och koncentrationen av den nya toppen beräknas, och resultaten visas i tabell 3. Inga nya toppar detekterades i proverna som inte autoklaverades, oavsett närvaron av NaOH i lösningen (prov 1-4, tabell 3).För autoklaverade prover detekteras nya toppar endast i närvaro av NaOH i lösningen, och bildningen av toppen verkar bero på NaOH-koncentrationen i lösningen (prov 5-8, Tabell 3) (RRT = 0,79).Figur 5 visar ett exempel på ett jonkromatogram som visar två autoklaverade prover i närvaro eller frånvaro av NAOH.
Förkortningar: BDDE, 1,4-butandioldiglycidyleter;LC-MS, vätskekromatografi och masspektrometri;MRM, multipel reaktionsövervakning.
Obs: Det övre kromatogrammet: Provet behandlades med 0,1% NaOH-vattenlösning och autoklaverades (120°C under 20 minuter).Bottenkromatogram: Provet behandlades inte med NaOH utan autoklaverades under samma förhållanden.Massomvandlingen av 203,30/129,10 Da (i positivt MRM-läge) analyserades med LC-MS.
Förkortningar: BDDE, 1,4-butandioldiglycidyleter;LC-MS, vätskekromatografi och masspektrometri;MRM, multipel reaktionsövervakning.
I alla autoklaverade prover, med eller utan NaOH, reducerades BDDE-koncentrationen kraftigt (upp till 16,6 gånger) (prov 5-8, tabell 2).Minskningen av BDDE-koncentrationen kan bero på att vatten vid höga temperaturer kan fungera som en bas (nukleofil) för att öppna epoxidringen av BDDE för att bilda en 1,2-diolförening.Den monoisotopiska kvaliteten hos denna förening skiljer sig från den hos BDDE och kommer därför inte att påverkas.LC-MS upptäckte en massförskjutning på 203.30/129.10 Da.
Slutligen visar dessa experiment att genereringen av nya toppar beror på närvaron av BDDE, NAOH och autoklaveringsprocessen, men har ingenting att göra med HA.
Den nya toppen som hittades vid en retentionstid av cirka 2,71 minuter karakteriserades sedan av LC-MS.För detta ändamål inkuberades BDDE (9,9 mg/ml) i en 1% vattenlösning av NaOH och autoklaverades.I tabell 4 jämförs egenskaperna för den nya toppen med den kända BDDE-referenstoppen (retentionstid cirka 3,47 minuter).Baserat på jonfragmenteringsanalysen av de två topparna kan man dra slutsatsen att toppen med en retentionstid på 2,72 minuter visar samma fragment som BDDE-toppen, men med olika intensiteter (Figur 6).För den topp som motsvarar retentionstiden (PIS) på 2,72 minuter observerades en mer intensiv topp efter fragmentering vid en massa av 147 Da.Vid BDDE-koncentrationen (9,9 mg/ml) som användes i denna bestämning, observerades också olika absorbanslägen (UV, X=200 nm) i det ultravioletta spektrumet efter kromatografisk separation (Figur 7).Toppen med en retentionstid på 2,71 minuter är fortfarande synlig vid 200 nm, medan BDDE-toppen inte kan observeras i kromatogrammet under samma förhållanden.
Tabell 4 Karakteriseringsresultat av den nya toppen med en retentionstid på cirka 2,71 minuter och BDDE-toppen med en retentionstid på 3,47 minuter
Obs: För att få dessa resultat utfördes LC-MS- och HPLC-analyser (MRM och PIS) på de två topparna.För HPLC-analys används UV-detektion med en våglängd på 200 nm.
Förkortningar: BDDE, 1,4-butandioldiglycidyleter;HPLC, högpresterande vätskekromatografi;LC-MS, vätskekromatografi och masspektrometri;MRM, multipel reaktionsövervakning;m/z, förhållande mellan massa och laddning;PIS, produkt Jonskanning;ultraviolett ljus, ultraviolett ljus.
Obs: Massfragmenten erhålls genom LC-MS-analys (PIS).Toppkromatogram: masspektrum av BDDE-standardprovfragment.Bottenkromatogram: Masspektrumet för den nya toppen som detekteras (RRT associerad med BDDE-toppen är 0,79).BDDE bearbetades i 1% NaOH-lösning och autoklaverades.
Förkortningar: BDDE, 1,4-butandioldiglycidyleter;LC-MS, vätskekromatografi och masspektrometri;MRM, multipel reaktionsövervakning;PIS, produktjonskanning;RRT, relativ retentionstid.
Figur 7 Jonkromatogram av 203,30 Da-prekursorjonen och (A) den nya toppen med en retentionstid på 2,71 minuter och (B) UV-detekteringen av BDDE-referenstoppen vid 3,46 minuter vid 200 nm.
I alla producerade tvärbundna HA-hydrogeler observerades att den kvarvarande BDDE-koncentrationen efter LC-MS-kvantifiering var <2 ppm, men en ny okänd topp dök upp i analysen.Denna nya topp matchar inte BDDE-standardprodukten.BDDE-standardprodukten har också genomgått samma kvalitetsomvandling (MRM-konvertering 203.30/129.10 Da) analys i positivt MRM-läge.I allmänhet används andra analytiska metoder såsom kromatografi som gränstester för att detektera BDDE i hydrogeler, men den maximala detektionsgränsen (LOD) är något lägre än 2 ppm.Å andra sidan har hittills NMR och MS använts för att karakterisera graden av tvärbindning och/eller modifiering av HA i sockerenhetsfragmenten av tvärbundna HA-produkter.Syftet med dessa tekniker har aldrig varit att kvantifiera kvarvarande BDDE-detektion vid så låga koncentrationer som vi beskriver i den här artikeln (LOD för vår LC-MS-metod = 10 ppb).
Posttid: 2021-01-01